Práctica 13. Identificación de proteínas por inmunoelectroforesis

OBJETIVOS

•  El objetivo de esta práctica es separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de albúmina e Ig G.

UTILIDAD CLÍNICA

• En el laboratorio clínico, la inmunoelectroforesis se utiliza diagnósticamente. Se utiliza en el examen de ciertas anomalías del suero, especialmente aquellas que implican inmunoglobulinas, proteína de orina, líquido cefalorraquídeo, fluidos pleurales y otros fluidos corporales. En la investigación, este procedimiento puede usarse para monitorizar purificaciones de antígenos y/o anticuerpos, detectar impurezas, analizar antígenos solubles de tejidos vegetales y animales y extractos microbianos.

FUNDAMENTOS

• La inmunoelectroforesis es una técnica de separaciçon e identificación de sustancias que atraviesa dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforetico y se rellena con un Ac antiproteína adecuado.
• La difusión del Ag y del Ac permitirá que ambos se unan y reaccionen entre sí formando un comple Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

MATERIALES

Cubeta y molde electroforesis

Molde

Fuente alimentación

REACTIVOS

PROCEDIMIENTO

• Preparamos el gel y realizamos la electroforesis.

1. Preparamos el tampón de electroforesis diluyendo el total del bote que lo contiene en forma concentrada en 960 ml de agua destilada para obtener un volumen total de tampón de 1000 ml.
2. Preparamos la solución para el gel de agarosa.
1. Añadimos la cantidad fijada de agarosa en 100 ml del tampón de electroforesis.
   
2. Calentamos en microondas.
   
3. Enfriamos la solución hasta 60ºC.
3. Pipeteamos la cantidad necesaria de gel agarosa (100 ml) en la bandeja de la cubeta de electroforesis. Antes de que solidifique, introducimos el molde para los carriles.
   
   
   
   
4. Cuando el gel haya solidificado, extraemos el molde para los carriles.
5. Hacemos los pocillos en el gel con una pipeta pasteur. Dejamos 0,5 cm de distancia entre cada pocillo y los carriles contiguos.
6. Colocamos papel de filtro en cada uno de los extremos en la bandeja de electroforesis.
   
7. Vertimon tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos.
   
8. Dispensamos 20 microlitros de cada Ag en los pocillos correspondientes.
   
9. Cerramos la tapa de la cubeta, y la conectamos a la fuente de alimentación y aplicamos un voltaje de 125 V durante 40 minutos.
10. Una vez finalizada la electroforesis, desconectamos la fuente de alimentación y quitamos la tapa de la cuneta. Retiramos el papel de filtro y depositamos la bandeja del gel en superficie horizontal para proceder a la fase de difusión de Ag y Ac.
11. Añadimos 50 microlitros de cada Ac en el carril correspondiente. Dispensamos el Ac procurando que se distribuya por todo el carril.
12. Colocamos la bandeja con el gel en una cámara húmeda.
13. Tras 48 horas, serán visibles los arcos de precipitación en el gel.

RESULTADOS

• La práctica no fue realizada correctamente, por lo que los resultados no son válidos. En el punto 9 hubo un error, y dispensamos también los Ac que debíamos dispensar en el paso 12.