Práctica 14. Rubeóla IgG Elisa 28/01/2020

OBJETIVOS

El objetivo de esta práctica es realizar un "elisa" para detectar un antígeno específico.

Esta técnica se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.

La técnica ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ‘ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas’) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.

Preparamos un pocillo para sustrato blanco, 5 pocillos para calibradores y un pocillo para las muestras.
Pipeteamos 100 microlitros en cada pocillo de calibradores.
En el pocillo de la muestra añadimos 100 microlitros de muestra diluida 1:10.
Tapamos la placa e incubamos 60 minutos a temperatura ambiente.
Después de incubar, aspiramos o volcamos el líquido de los pocillos.
Lavamos 3 veces con 300 microlitros de solución de lavado, evitamos rebosar los pocillos.
Pipeteamos 100 microlitros de conjugado anti-IgG en todos los pocillos, excepto el blanco.
Tapamos e incubamos 30 minutos a temperatura ambiente.
Repetimos el paso 6 tres veces.
Pipeteamos 100 microlitros de sustrato en todos los pocillos, incluido el blanco.
Tapamos e incubamos 20 minutos en la oscuridad.
Pipeteamos 100 microlitros de solución incluyendo el blanco.
Leemos la absorción a 450 o 620 nm. El color es estable durante 60 minutos.

Para obtener resultados cuantitativos en uindades internacionales por ml se realiza una curva de calibración con la A en el eje y y la concentración de los calibradores en el eje x.