Práctica 8. TPHA. Hemaglutinación en porta 29/10/2019

OBJETIVOS

•  El objetivo de esta práctica es realizar una determinación cualitativa de anticuerpos anti-Treponema pallidum en suero humano.

UTILIDAD CLÍNICA

• La sífilis es una enfermedad venérea provocada por la infección de T. pallidum. La transmisión del microorganismo se produce por contacto durecto a través de una lesión productiva. El periodo de incubación es aproximadamente de 20 días y la enfermedad progresa a través de 3 fases distintas con sintomatología diferente. Los anticuerpos anti-Treponema aparecen a partir de la primera fase y pueden permanecer en un 85-90% de pacientes tratados a pesar de haber superado la enfermedad.

FUNDAMENTOS

• TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination) es una prueba de hemoaglutinación indirecta en microplaca para la detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero humano. 
• Los hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con una solución antigénica de T. pallidum, aglutinan en presencia de anticuerpos anti-T.pallidum mostrando unos patrones de aglutinación característicos.

MATERIALES

Placa de microtitulación con fondo en "U"

Puntas para micropipeta

Micropipeta

REACTIVOS

• R1: Células Test (TC): hematíes de ave estabilizados y sensibilizados con antígenos de T. pallidum.
• R2: Células Control (CC): suspensión estabilizada de hematíes de ave.
• R3: Diluyente (DIL): tampón fosfato.
• Control +
• Control -

PROCEDIMIENTO

• MÉTODO CUALITATIVO.

1. Atempermos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.
2. Preparamos una dilución 1:20 de la muestra en diluyente (10 μL suero + 190 μL diluyente).
3. Pipeteamos en pocillos adyacentes de una placa de microtitulación:
   
4. Agitamos suavemente la placa hasta la completa homogeneización de las mezclas.
   
5. Cubrimos la placa y dejamos incubar a temperatura ambiente durante 45-60 min. 

• MÉTODO SEMICUANTITATIVO. 

1. Realizamos diluciones dobles a partir de la dilución 1:20 de la muestra en diluyente.
2. Ensayar cada dilución como se describe en el método cualitativo, añadiendo 75 μL de células test (R1).
   
3. Tapamos la placa con parafilm y dejamos reposar.
   

RESULTADOS

•  Examinamos macroscópicamente. Los resultados deben ser leídos comparando los patrones de aglutinación de las Células Test con los de las Células Control.
• Los pocillos que muestran un anillo más o menos grande, presentan reacción negativa.
• Los pocillos que muestran un velo rojo/marrón que tapiza el pocillo, presentan reacción positiva.